那么如何能控制ELISPOT檢測(cè)的質(zhì)量呢？如果有一種細(xì)胞和一種刺激物，并且ELISPOT斑點(diǎn)頻率是已知的話，那么就有了一個(gè)ELISPOT的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)。每次其它樣品檢測(cè)時(shí)，只要帶上這個(gè)系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)者就可以用標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)來質(zhì)控待測(cè)樣品的ELISPOT檢測(cè)。這也是所有其它檢測(cè)質(zhì)控的基本原理。

      現(xiàn)在的關(guān)鍵是找到這樣一種細(xì)胞和一種刺激物，每次都能做出完全相同的ELISPOT結(jié)果。

二、標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞必須采用凍存細(xì)胞庫(kù)

     首要問題是細(xì)胞。我們知道，細(xì)胞是有生命的，不像無(wú)生命的物質(zhì)那樣容易保存。那么能不能采用新鮮細(xì)胞呢，比如每次都從同一個(gè)志愿者身上采集？不能。因?yàn)橹驹刚叩慕】禒顟B(tài)和免疫狀態(tài)都是動(dòng)態(tài)的，雖說采自同一個(gè)人，但是細(xì)胞免疫水平可能會(huì)有變化，ELISPOT結(jié)果無(wú)法完全重復(fù)。那么能不能采集細(xì)胞之后長(zhǎng)期飼養(yǎng)呢？不能。且不說長(zhǎng)期培養(yǎng)成本高且周期長(zhǎng)，細(xì)胞本身的免疫水平和克隆數(shù)目都會(huì)隨著培養(yǎng)和傳代而發(fā)生變化。

      能滿足ELISPOT檢測(cè)長(zhǎng)期不變化的只能是凍存細(xì)胞庫(kù)。一次采集大量細(xì)胞凍存在-197°C的液氮環(huán)境中，細(xì)胞的斑點(diǎn)頻率可以在數(shù)年之內(nèi)恒定不變。PBMC分離和凍存復(fù)蘇的方法參見本網(wǎng)站內(nèi)容。

三、標(biāo)準(zhǔn)刺激物選用CEF或者ICE

     那么，刺激物選擇什么呢？非特異性的刺激物很便宜，但是不能用于質(zhì)控。三個(gè)原因阻礙了這一點(diǎn)。

    其一、非特異性的刺激物刺激效果不穩(wěn)定。如圖9.2所示，非特異性的刺激物（有絲分裂原Mitogen）的刺激曲線幾乎沒有平坦的部分。也就是說，刺激物的濃度有細(xì)微變化，馬上就會(huì)體現(xiàn)在刺激斑點(diǎn)數(shù)目的變化上了，這樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果很難完全重現(xiàn)。相反，抗原的刺激曲線非常平坦，只要達(dá)到有效刺激濃度，斑點(diǎn)頻率就不再變化。

     其二，非特異性刺激物的刺激原理與特異性的刺激物刺激原理不同。一般來說，質(zhì)控系統(tǒng)和被質(zhì)控的體系之間越相近越好：經(jīng)過相同的處理，接受相同的影響因素，發(fā)生相同的物理、化學(xué)、生物過程。但是非特異性刺激物刺激是單細(xì)胞過程，與抗原經(jīng)APC呈遞而刺激T細(xì)胞是完全不同的過程。所以用非特異性刺激反應(yīng)質(zhì)控與特異性刺激反應(yīng)質(zhì)控，從原理上也說不同。

     其三，非特異性刺激物多數(shù)是蛋白質(zhì)，比如PHA與ConA，效價(jià)不穩(wěn)定，容易失活，不易保存。相對(duì)而言，作為抗原的蛋白和多肽，免疫原性和刺激效果要穩(wěn)定得多。

      綜上所述，在質(zhì)控系統(tǒng)中，標(biāo)準(zhǔn)刺激物宜選用抗原?？乖校訲細(xì)胞表位肽組成簡(jiǎn)單，機(jī)理清楚，結(jié)果穩(wěn)定，所以是首選。再則考慮到標(biāo)準(zhǔn)刺激物對(duì)健康人的T細(xì)胞也應(yīng)該能刺激作用，所以國(guó)際上選定三種常見病毒CMV、EBV、Flu Viurs，把它們的32條T細(xì)胞表位肽集中起來，作為ELISPOT標(biāo)準(zhǔn)樣性刺激物CEF。另有簡(jiǎn)化版的23條肽肽庫(kù)ICE（貨號(hào)CT370），更加實(shí)用。 

 四、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控與實(shí)驗(yàn)室之間的質(zhì)控以及國(guó)家質(zhì)控體系

      以上介紹了ELISPOT質(zhì)控系統(tǒng)的原理與組成?，F(xiàn)在來介紹一下質(zhì)控系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。根據(jù)質(zhì)控系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，可以分為以下三個(gè)層次。

     基本的層次是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控系統(tǒng)。比如一個(gè)實(shí)驗(yàn)室有好幾組實(shí)驗(yàn)人員，會(huì)在很長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)（一年或數(shù)年）做高質(zhì)量的ELISPOT檢測(cè)。這就需要用到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的質(zhì)控系統(tǒng)。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室內(nèi)部的條件相對(duì)穩(wěn)定，管理相對(duì)統(tǒng)一，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控系統(tǒng)的技術(shù)目前已經(jīng)非常成熟。達(dá)科為公司有整套建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部ELISPOT質(zhì)控系統(tǒng)的方案，已經(jīng)幫國(guó)內(nèi)數(shù)家實(shí)驗(yàn)室建立了這一系統(tǒng)。實(shí)踐也證明了該系統(tǒng)有效可行，指控效果非常明顯。

     第二個(gè)層次是實(shí)驗(yàn)室之間的質(zhì)控系統(tǒng)。當(dāng)今的科研有合縱連橫的趨勢(shì)，一些重大的科研項(xiàng)目或者疫苗的臨床評(píng)估往往是跨實(shí)驗(yàn)室、跨地域甚至跨國(guó)家的聯(lián)合項(xiàng)目。為了使這些分布在不同地區(qū)不同時(shí)間的ELISPOT檢測(cè)有相同的標(biāo)準(zhǔn)和可信度，必須采用實(shí)驗(yàn)室之間的質(zhì)控系統(tǒng)。就我們達(dá)科為公司與國(guó)內(nèi)十余家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合作的評(píng)估而言，實(shí)驗(yàn)室之間的質(zhì)控存在唯一的一個(gè)非技術(shù)障礙，那就是凍存質(zhì)控細(xì)胞的運(yùn)輸問題。

     凍存細(xì)胞更好能通過液氮運(yùn)輸，如果采用小型背負(fù)式液氮罐，實(shí)驗(yàn)者可以在同一城市的不同實(shí)驗(yàn)室之間運(yùn)輸凍存細(xì)胞，但是對(duì)于跨城市或者跨國(guó)家的長(zhǎng)途運(yùn)輸就不太可能了。液氮罐上飛機(jī)或者火車都是非法的。如果采用干冰運(yùn)輸，凍存細(xì)胞的狀態(tài)和存活率就會(huì)打折扣。我們的研究表明，經(jīng)過干冰運(yùn)輸?shù)募?xì)胞，存活率只有80%左右。并且干冰運(yùn)輸?shù)目煽啃砸膊荒芡耆玫奖ＷC，一旦干冰耗盡或者細(xì)胞未完全被干冰包裹，細(xì)胞的存活率就會(huì)直線下降，甚至完全死亡。

     第三個(gè)層次是國(guó)家質(zhì)控系統(tǒng)。任何成熟的檢測(cè)技術(shù)都會(huì)有相應(yīng)過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控系統(tǒng)。但是由于ELISPOT技術(shù)還在發(fā)展中，目前世界上還沒有任何一個(gè)國(guó)家建立了ELISPOT技術(shù)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控系統(tǒng)。美國(guó)是該項(xiàng)工作開展得比較早的國(guó)家，目前仍然在不同實(shí)驗(yàn)室之間作驗(yàn)證工作，研究建立質(zhì)控系統(tǒng)的可行性。

    如表9.1所示，這是我們一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。可以看到，前三個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果重復(fù)性很好，但是第四個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果明顯偏小。